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DNA在自由基(如·OH)的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破坏，磷酸二脂键的断裂，碱基的破坏或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA分子向阳极移动。如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用PI染色或银染，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。

• 1%正常熔点琼脂糖凝胶配制：根据琼脂糖凝胶的浓度和体积计算出所需琼脂糖的重量，称取适量正常熔点琼脂糖(NMA)加入合适的容器(如50mL离心管)中，加入适量的PBS后加热溶解。例如100mg正常熔点琼脂糖中加入10mL PBS，适当晃动混匀琼脂糖粉末，微波炉加热煮沸琼脂糖溶液或置于90～100℃水浴中至完全溶解。随后置于45℃水浴中冷却后备用。未使用完的1%正常熔点琼脂糖凝胶可在4℃保存，下次重新熔解后使用。
  
  如有必要可以在液面处作一标记，以便于部分水分挥发后可以用超纯水或去离子水补充至最初的体积。
  
  
• 0.7%低熔点琼脂糖凝胶配制：根据琼脂糖凝胶的浓度和体积计算出所需低熔点琼脂糖的重量，称取适量低熔点琼脂糖(LMA)加入合适的容器(如50mL离心管)中，加入适量的PBS后加热溶解。例如70mg低熔点琼脂糖中加入10mL PBS，适当晃动混匀低熔点琼脂糖粉末，70～80℃水浴5～10分钟，使琼脂糖溶液完全溶解。随后置于37℃水浴中冷却至少20分钟后备用。未使用完的0.7%低熔点琼脂糖凝胶可在4℃保存，下次重新熔解后使用。
  
  • 低熔点琼脂糖在37℃水浴中冷却至少20分钟非常重要，否则过高的温度会引起DNA的损伤。
    
  • 低熔点琼脂糖最好在70～80℃水浴中溶解，不要用微波炉。
    
  • 低熔点琼脂糖溶液可以在37℃保持溶液状态1～2小时。

• 贴壁细胞：收集细胞上清(含悬浮的细胞)，贴壁细胞用胰酶消化，收集细胞悬液后和收集的细胞上清混合，离心去除上清。细胞用冰浴预冷的PBS洗涤一次，离心收集细胞沉淀，加入适量PBS重悬使细胞密度为1×10⁶个/mL。
  
• 悬浮细胞：收集细胞悬液后离心去上清，细胞用冰浴预冷的PBS洗涤一次，离心收集细胞沉淀，加入适量的PBS重悬使细胞密度为1×10⁶个/mL。

• 细胞最好是新鲜制备的。如果使用冻存的细胞，需要先确定冻存是否会对细胞造成额外的DNA损伤。
  
• 每次实验，需要设置未经处理的正常细胞作为空白对照(Control)。

• 制片：
  
  • 第1层凝胶的制备：该层为1%正常熔点琼脂糖凝胶。将载玻片的磨砂面朝上，45℃预热，将预热的30μL 1%正常熔点琼脂糖凝胶铺在载玻片上，盖上盖玻片，4℃放置10分钟使其凝固。轻轻移去盖玻片，室温放置备用，此时凝胶为薄薄的一层。
    
    • 盖上盖玻片时须避免产生气泡。
      
    • 移去盖玻片时先轻轻推移，使盖玻片适当移位后，再用尖头镊子慢慢掀开，避免把胶弄破。去掉盖玻片后，室温放置晾干过夜，第一层凝胶的贴壁效果更好。18×18mm的盖玻片比24×24mm的更容易移去，推荐使用18×18mm的盖玻片。
      
    • 对于未测试过的载玻片，建议先确定正常熔点琼脂糖凝胶在该载玻片上不脱落。也可使用适当的毛玻璃或磨砂载玻片，凝胶不容易脱落，也不影响后续荧光观察。
  • 第2层凝胶的制备：该层为含有细胞悬液的低熔点琼脂糖。将10μL细胞(约10⁴个)和75μL 37℃水浴的0.7%低熔点琼脂糖混合均匀，然后迅速吸取70μL滴加到第一层凝胶上，用移液器吸头轻轻的铺开铺匀，覆盖整个第一层胶，或盖上盖玻片，4℃放置10分钟使其凝固。
    
    • 铺胶时须避免有气泡产生。如样品较多，可以在放置在37℃水浴中的1.5mL离心管中分装好低熔点琼脂糖，再加入细胞混匀，混好后及时铺胶，防止胶凝固。
      
    • 一般情况，只需用移液器吸头轻轻的铺开铺匀，无须盖上盖玻片。盖上盖玻片，后续移去时可能会使第二层凝胶脱落。
  • 第3层凝胶的制备(选做)：第二层凝胶凝固后，滴加75μL 37℃预热的0.7%低熔点琼脂糖。盖上一片新盖玻片，4℃放置30分钟使其凝固。铺胶时须避免有气泡产生。
    
    • 双层凝胶法制片，既能使凝胶有较好的附着，又能使细胞尽可能多的处于同一平面，染色效果更好；三层胶一定程度上解决了脱落漂浮的问题，但可能会影响观察的效果。
• 细胞裂解：
  
  • 裂解液的配制：按照Lysis Buffer与DMSO的比例为9:1配制裂解液，例如取9mL Lysis Buffer加入1mL DMSO，混匀即得10mL裂解液。配制完毕后，置于4℃预冷备用。
    
    • 裂解液须现用现配。裂解液在室温可能会出现浑浊，充分混匀后或混匀后置于4℃会变澄清。
      
    • 如果细胞或组织样品中含有红细胞或血红蛋白，DMSO可避免其中的亚铁血红素中的铁催化产生的活性氧而导致的DNA损伤。如果样品中不含血红蛋白或亚铁血红素，裂解液中也可以不加入DMSO。
  • 如果有盖玻片，参考”第1层凝胶的制备”步骤，轻轻移去盖玻片，将载玻片置于10cm培养皿中，倒入约10mL预冷的裂解液，淹没凝胶和载玻片。4℃裂解1～2小时或过夜，取出载玻片用PBS漂洗3分钟。
• DNA解旋：将载玻片置于水平电泳槽中，倒入电泳缓冲液，至少高于载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20～60分钟。该步骤使DNA双链在碱性条件下解螺旋，并使断裂的小片段DNA在电场中易于迁移。
  
• 电泳：电泳可在任何水平电泳槽中进行，电泳电压一般为低电压25V (0.75～1V/cm)，电泳时间通常在20～30分钟的短时间内进行。
  
  • 电泳时宜低温最好是冰浴，并避光。推荐在冷库或4℃冰箱中避光电泳。不同电泳槽的电泳时间需要适当调整，保持电场强度约0.75～1V/cm即可。
    
  • 电压过高或电泳时间过长，非受损细胞的DNA也可能会出现彗星形态的假阳性结果；反之，电压过低或时间过短，小片段DNA电泳不充分，受损细胞无彗星拖尾而造成假阴性结果。
• 中和与染色：电泳后将载玻片置于平皿内，加入中性缓冲液[0.4mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)]，将载玻片没入即可，4℃中和1～3次，每次5～10分钟，弃去中性缓冲液，在载玻片上滴加约20μL PI溶液，避光染色10～20分钟。然后超纯水洗涤3次，盖上盖玻片，随后即可在荧光显微镜下观察。
  
  • 凝胶在细胞裂解、DNA解旋、电泳和中和之后与载玻片的结合可能不如之前紧密，因此在电泳和中和后要轻取轻放，宜水平轻轻取出，以免凝胶脱落。
    
  • 如果使用透明载玻片，一般中和1次，5分钟即可，中和次数越多，凝胶越容易脱落。中性缓冲液浸没载玻片即可，太多会使凝胶脱落。
    
  • 也可以使用EB、DAPI、SYBR Gold、SYBR Green、NA-Red、Gel-Red、NA-Green、Gel-Green等荧光染料或银染的方式进行染色，并用相应的检测方法进行检测。
• 观察、拍照和实验结果分析：
  
  • 观察和拍照：在荧光显微镜下观察，碘化丙啶(PI)为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。
    
  • 结果分析：碱性彗星电泳测定DNA损伤常见的性状指标有彗星细胞率，距离指标有彗星总长、尾长、彗星头部半径、彗星尾部半径等，强度指标有头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等，矩类指标包括尾矩等。尾长(Length of Tail)，即未损伤的大分子DNA和损伤的小分子DNA迁移的长度差(图中的Tail)，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系；尾部DNA百分比(Percentage of DNA in the Tail,Tail DNA%)，是尾部占总细胞DNA的百分比；尾矩(Tail Moment)，即尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系，是结合了尾部DNA的量与相对于细胞核的迁移距离。最重要的两个指标是尾部DNA百分含量和尾矩，具体计算方式如下：
    Tail DNA (%) = 100×Tail DNA Intensity/Cell DNA Intensity
    Tail Moment有两种计算方式：
    
    • Olive Tail Moment=Tail DNA (%)×Tail Moment Length*
      
    • Extent Tail Moment=Tail DNA (%)×Length of Tail
    Tail Moment Length is measured from the center of the head to the center of the tail (参见下图)。
    
    图1.彗星电泳中细胞DNA损伤的尾矩
    
  • DNA损伤判定：每个样本随机选择50～100个细胞，测定相应指标。
    DNA损伤按慧星尾部DNA量占全部DNA量的比例分为5级：
    

    0级	＜5%	无损伤
    1级	5～20%	轻度损伤
    2级	20～40%	中度损伤
    3级	40～95%	高度损伤
    4级	＞95%	重度损伤